Virološki študije. Črevesnih bolezni. (Part 1)

Izolacija virusa. Dokaz protivirusnega sredstva - Vzbujevalnik patološkega stanja je glavni triado Koch dokaz vzročni zvezi okužbe. V zvezi s tem, virus izolacija je izredno pomembna in je temeljni člen v verigi dogodkov za laboratorijsko diagnostiko rotavirusi. Poleg prelivanja ostaja ena izmed redkih praks, ki jih je mogoče spremljati z odkritjem novih virusnih, agenti v neznano zdaj virusne bolezni. Zato, virus izolacija v različnih bioloških modelov (v večini primerov - kultura celice), se zelo pogosto vadili. Trenutno kot biološki vzorec najpogosteje uporabljajo številne celičnih kultur: MA104, 4647, GBK, HT-29, CV1, Vero, Caco-2, itd (Ramishvili L. G. et al, 1991, J. Hapchaev .. X. et al., 1989- Clark N. et al., 1988- Konno T. in sod., 1993- Ward R. et al., 1990- Bernstein D. et al., 1989- Sato K. s sod. , 1995- Weber B. s sod., 1992- Markovska-Daniel J. et al., 1996- Shinozaki K. et al., 1996- Superti F. et al., 1997).

Izolacija virusa v celičnih kulturah izvedemo v 2 korakih: virusna infekcija celičnih kultur (I) in njegova uporaba za dokumentiranje videz CPE ali ELISA, škodljivci, stran, PCR metoda plyakoobrazovaniya TEM in (II). Zaradi posebnega pomena te metode si dovolimo nekaj podrobnosti. Vzorci blata delo v prvih 2-3 dni bolezni v sterilnem laboratorijsko steklovino in transportira v posodi z ledom ali drugo hladilno sredstvo. Testni material je treba zdraviti takoj po dostavi v laboratoriju ali shranimo pri temperaturah pod ničlo. Preden se začnejo virološki vzorce odtalili vzeta 0,5-1 g fekalije in gojišče dodamo (Eagle, Earl, Henke) v količini, ki je potreben, da dobimo 10% gošča. Gomogeneziruyut brozgo ponavljamo, dokler enotno močnim stresanjem (z ali brez kroglice), ali z zamrzovanjem in odtajanju. Homogenizacija gošče bolj rahlem stresanju, t. K. Virusosoderzhaschego zamrzovanje in taljenje materiala vodi do degradacije VP7 (Nirdnoy W. et al., 1995). Suspenzijo centrifugiramo 10-15 minut pri 1000-2000 g, očiščen sedimenta in supernatant zlijemo vendar 1 ml za študij virološko ali shranimo pri -20-70 ° C, odvisno od obdobja skladiščenja. Nato je bil virus aktivira 30 minut pri 37 ° C s tripsinom pri koncentraciji od 10 ug / ml, in centrifugiramo 2 minuti pri 15000 g. Nato štiridnevni enoplastna dvakrat izperemo z DMEM in okužijo 1-2 LG (10-30 virusnih delcev na celico) na aktivirano RV medija (DMEM, Eagle MEM s Hanks), ki vsebuje 10% fetalnega telečjega seruma in antibiotiki. Po različnih avtorjev, ki jih uporabljamo 100-500 enot. penicilin, 100-500 mg streptomicina, 40 mg gentamicina in 50 enot. nistatin v 1 ml. Po 2-urni adsorpcije pri 37 ° C, smo celice izprali in naložen z DMEM, ki vsebuje antibiotike in 4-13 ug / ml tripsina (Clark N. et al., 1988- Sato K. s sod., 1995).

Pozitiven učinek na tripsin pokazala rotavirusom procese replikacije in T. Konno et al. (1993). Avtorji so potrdili, da tripsin aktivira proizvodnjo virusa s selektivno vplivajo na delovanje VP4 in zunanjo kapsidnem proteinu, ki jih v ustih. To vodi, na eni strani, da se zmanjša GEMAG-glyutiniruyuschey virus dejavnost, in na drugi strani - okrepiti vdor virusa v celico, ki se obravnavajo z tripsina virioni vstopiti v celico in jo posnemati, in surova - .. opraviti endocitozo, in niso ponovili. Tako je uporaba tripsina v dozi od 0,1 do 10 mg / ml, kar povečuje infektivnosti virusa. 5-7 dni Ugotovili so okužene celične kulture. Videz CPE kaže na prisotnost virusa, ki ga nato dokumentirano TEM EF PAGE z uporabo antiserumov ali - IEM in IFM al.

Če bi CPE ne zamrznjeni kulture in tvorijo dodatna prehode pod enakimi pogoji, razen da je virus aktivira z obdelavo s tripsinom 4 ug / ml pri sobni temperaturi 2 uri.

Ker prehod 4, CPE navadno zaznan po 4-5 dni po okužbi (Ward R. et al., 1990- Bernstein D. et al., 1989).

Vendar pa je zaradi nizke občutljivosti na celičnih kulturah naravno izolira rutinske diagnostične metode rotavirusni gastroenteritis med prašijo ni bilo. Ker lahko neprilagojeni izolacije celice reproducirajo v njih ne da bi odkrivanje CPE virusa z dodatnimi metodološih tehnike znatno poveča učinkovitost metode. To potrjujejo študije W. Weber et al poteka. (1992). Avtorja, skupaj z odkrivanjem rotavirusom CPD izvedla primerjalno študijo različnih metod za odkrivanje rotavirusa v okuženih celicah, ki jih preučuje 121 blata vzorcev otrok z gastroenteritisom pred mlajših od 3 let. Standardni izbor v MA 104 celic pod nadzorom CPP pokazala le 3,3% pozitivnih rezultatov, ker uporaba oznak imunoperoksidazni diagnostični stopnja zvišala na 40,5%, in uporaba IFA in EF STRAN - do 54,4% in 46,3 %, oz.

Ker se HRV vedno ne povzroči CPE in replicirati v običajnih celičnih kulturah, GENTHE V. et al. (199TS po 18 urah kultiviranja pri MA-104 z virusno intracelularni antigen ELISA detektiramo z uporabo antiserumov, peroksidazni označeni. Primerjava tsitoimmunnoy art označenih protiteles s komercialnimi za določanje testnih sistemov, test ELISA in lateks aglutinacijski pokazala, da tsitoimmunny Metoda 10-krat bolj občutljiva.

Podobne rezultate smo dobili v zadnjih letih. Torej po Markowska-Daniel J. et al., ELISA rotavirusa v blatu so našli v 32% primerov. Uporaba MA-104 kulturi in virus razmnoževanje dokumentov škodljivcev, TEM in EF PAGE celic povečal odstotek zaznavanje virusov na 64,0% (Markowska-Daniel J. et al., 1996).

Klasični substrat za reprodukcijo rotavirusni je ledvični celični liniji MA-104 opica, ki se najpogosteje uporablja, ne samo za diagnosticiranje, ampak tudi za raziskovalne namene (Johansen K. et al., 1997- Kobayashi N. in sod., 1995) in tudi v veterinarski praksi (Gulati V. et al., 1997). Izkazalo se je, da MA-104 podpira ne le reprodukcijo rotavirusi skupine A in C, vendar pod pogojem, pri visoki koncentraciji v tripsina gojišče vsebine (Tsunemitsu N. in sod., 1991). Vendar pa je zaradi nezadostne občutljivosti celic na rotavirusi je potekala tudi iskanje drugih linij, celic in metod, primernih za izolacijo in reprodukcijo rotavirusi in razvoj metod za povečanje občutljivosti celic rotavirusi. Ugotovljeno je bilo, da je humana celična linija karcinom kolona HT-29 bolj občutljiva kot MA-104 pri dodeljevanju humanega rotavirusa. Nasprotno, MA-104 HT-29 rotavirusa rast odkriti v prvih ali nadaljnjih prehodov, čeprav je bil delež okuženih celic nizka (Superti F et al., 1991, 1997).

Druga linija celic karcinom debelega črevesa Caco-2 je bila uporabljena tudi poudariti RV. Z uporabo te celične linije, v prisotnosti tripsina (4 ug / ml) smo izolirali Skupina C RV na Japonskem, ki je povzet brez CPP in je bila dokumentirana TEM IEM in IFM povratne TPHA (Shinozaki K. et al., 1996).

Celice ledvični linija govedo, GBK dobimo tudi višje rezultate titracijo rotavirusni izoliranih iz telet (1-2 lg v višjem od MA-104 celic). Opozoriti je treba, pa je, da celice predhodno obdelamo z dietilaminoetildekstranom dozi 50 ug / ml in v gojišču dodamo v kontsentartsii tripsin 5 g / ml (Konno T. in sod., 1993).

Povečanje občutljivosti celic z virusi na splošno, zlasti rotavirusni doseže s pomočjo v ta namen kemičnimi in fizikalnimi metodami. Izkazalo se je, da je centrifugiranje, konstantna ziblje ali nenadna toplotni učinek (toplotnega šoka) pospeševanje rasti števila poškodovanih celic, povečanje donosa virusa ali povečujejo stopnjo količine virusa v diagnostičnem raziskavah virologijo. Od treba opozoriti na kemične metode vplivanja učinkovitost dimetilsulfoksida, ki izboljšuje proces transformacije celice, okužene z virusom, plyak poveča število in velikost poveča dobitek virusa (Hyghes J. N., 1993). Tanjša identifikacija virusa lahko dosežemo s pomočjo plakov pod njeno vplivom v tkivni kulturi. Postopek izdelave plakov razvili Dulbecco R. (1952) v različnih izvedbah in se široko uporablja v tem trenutku. Princip metode je, da je razredčitev suspenzije virusa uporablja za enojno plast tkivnih kultur v petrijevkah ploskostennyh fiole, jamice plastične plošče. Po virusa adsorpcijo na celice, prekriti s plastjo agar hranil. Zaradi Agar kritje, razmnoževanje in širjenje virusa je omejena le na začetku okuženih in njihovih sosednjih celic. Tako oblikovana organsko degeneracijske celica žarišča - tako imenovani "plaki" (plyaki). Ponavadi so označene z obarvanjem s plastjo barvila intravital celice - nevtralno rdeče, ki je bodisi vključena v sestavi agar prevleko, bodisi uporabijo na njem neposredno pred podlagi rezultatov. Častne ne adsorbira barvilo in tako v obliki svetlih točk v ozadju obarvanih živih celic (Tosser J. et al., 1994).

Za odkrivanje plake razen nevtralno rdeče Lahko se uporabijo druge barvil, kot kristal vijoličnim. Ena infekciozne virusni delec predstavlja enotno ploščo, ki omogoča, da se uporabljajo blyash-koobrazovanie kot natančna metoda za kvantitativno preučevanje infektivnosti virusa in merjenje nevtralizacijo aktivnosti protitelo. Uporaba zobne obloge lahko jasno virus, tj. E. Prejemanje njene čiste linije (Isa R., Snodgrass D. 1994- Ward R. et al., 1998). Pri izvajanju takih sušilnica plast celic po adsorpciji virusa, ki je potreben, da temeljito oprati virusne delce iz adsorbiranih in šele nato uporablja agar prevleko. Opozoriti je treba, da dietilaminoetildenetrana (DEAE), je uporaba dimetilsulfoksida tripsin pozitivno vplivati ​​na nastajanje plaka (in znižanje agar koncentracijo v prevleki).

Shgapo N. in sod. (1987) uporablja metodo, da dobimo plošče za detektiranje Ramansko rotavirus pri novorojenih teletih primerjavo dveh linija celične kulture MA-104 in GBK (RNC ledvičnih celic). Potrjuje uporabo MA-104 celic, ki jih predlaga, da se v ta namen uporabi tudi GBK celice vrstice in razvili spremembo ploščo. Plastični petrijevko s premerom 6 cm posejali 0.8-1.0 x 106 celic v 5 ml rastnega gojišča. Potem ko so bile 2-3 dni po tvorbi enoslojne celic izperemo in dodamo 2 ml 0 rotavirusa (sev Lincoln) razredčimo v mediju kulture s 50 ug / ml DEAE. Po 90 minutah inkubacije pri 37 ° C smo v plasteh 5 ml gojitvenega medija z 0,8% agarja, 10% triptozo fosfat brozge, 5 g / ml tripsin in 50 ug / ml DEAE. Po 3 dneh, drugi plastna prevleka vsebuje nevtralno rdeče pri končnem razredčenju 1: 5000. Po 6-8 urah preštejemo chisyo plake.

Še ena sprememba dobimo plake stroje Bernstein D. et al. (1989) pri proučevanju ločitev seva cepiva pri odraslih prostovoljcih, cepljenih s cepivom proti rotavirusom WC 3. V ta namen se 1 ml predhodno obdelamo, kot je opisano zgoraj, so bili vzorci stolice inkubirali 30 minut pri 37 ° C s 10 ug tripsina in zasadili na monosloja ma- 104, izperemo dvakrat z uravnoteženo raztopino soli Earlovi. Po 1 Chasa eni plasti adsorpcije pri 37 ° C in izperemo enkrat zlijemo DMEM medij z antibiotiki, 4 mikrogramov / ml tripsina, 25 ug / ml DEAE in 0,2% agaroze in inkubirali 4 dni pri 37 ° C, drugi prevleka večplastna agar Po odstranitvi medija z kristal vijolično za vizualizacijo plyak.

Trenutno vizualizacija plyak doseči imunofluorescenco ali radioaktivne oznake, kot način, da poveča specifičnost in občutljivost (Isa R. et al., 1994).

Tako, odpadanje ostaja pomemben način za potrditev etiologiji bolezni, zdaj pa zaradi možnost uporabe široko paleto sodobnih diagnostičnih metod za njegovo uporabo kot rutinski diagnostični test zdi nepraktično.

Elektronska mikroskopija RV. Dokaz virusa z elektronsko mikroskopijo izvedemo v dveh sprememb: direktna elektronska mikroskopija (TEM) in immunnoelektronnaya mikroskopija (IEM).

Znano je, da v zgodnjih dneh vsebnosti rotavirusa bolezni kopromaterialah doseže tolikšnem obsegu, da omogoča njegovo odkrivanje z elektronskim mikroskopom D-20% suspenzije brez nadaljnjega koncentriranja. Potem smo suspenzijo zbistrili s centrifugiranjem nekaj kapljicami supernatanta raztopin kontrastnih fosfovolframove kisline (2,1%) uranilov acetat (0,25-1%) ali amonijev molibdat (1%) in se uporabljajo za elektronski mikroskop rešetke predmet. Študija drog izvedemo v elektronskem mikroskopu pri povečavi 50 pokazala 000. V lasti rotavirusom delcev je določena z značilno morfologijo.

Metoda neposredne elektronske mikroskopije (TEM) v različnih modifikacij uporabimo za diagnostične in raziskovalne namene precej široko (Vasil'yev B., J. et al., 1989, 1995, 1996- Zarubinsky B., J. et al., 1989- KHAUSTOV VI "sod. 1989- Shelkovskaya N. G. et al., 1991- Dennehy R. et al., 1990- Donneli G. et al., 1993- Zeng C. et al., 1994- Oishi J. s sod. , 1993- Gonzalez S. et al., 1995- Hendricks MK et al., 1995- Jiang B. s sod., 1995- Buesa J. et al., 1996- TINARI A. et al., 1996- Andrade GP et al., 1997- Superti F. et al., 1998).