Virološki študije. Črevesnih bolezni. (Part 2)

Uporaba metode TEM pokazala visoko specifičnost, vendar je njegova občutljivost je slabša od številnih drugih laboratorijskih testov. Študija materiali 207 iz dveh bolnikih z Diagnostični kompleti ELISA in TEM kot referenčna metoda je pokazala, da je občutljivost TEM 80% s 100% specifičnostjo, medtem ko je občutljivost testa ELISA na osnovi monoklonskih protiteles višja (Dennehy R., 1990). Podobne podatki so bili predhodno pridobljenimi Vasilevym B. J. et al. (1989). Primerljivih indeksov razmerja občutljivostjo in specifičnostjo TEM aglutinacija reakcijo lateksa (62,5% in 75%, v tem zaporedju) so tudi prikazani in Nozawa Santos N. S. (1989).

Nedavne študije so potrdili te ugotovitve. Preizkus 103 otrok metod TEM EF PAGE in lateks aglutinacijski reakcije (RLA) je pokazala, da je bila rotavirusa dokumentirano v 18% otrok. Poleg tega je občutljivost TEM tehnike EF PAGE in RLA bil sicer 84%, 90% in 80%, specifičnost kot 100%, 100% in 81%, v tem zaporedju (Hendricks M. K. et al., 1995). Poleg diagnostične namene, se TEM uporablja v raziskave in razvoj. Tako Zeng S. s sod. (1994) je bila uporabljena v študiji TEM rota-virusni proteina VP2.

Rezultati mikroskopijo slike zračna elektronov izmed razširjenih funkcij in montaža strukturni protein VP2, kakor tudi tvorba virusom podobnih delcev (HPV) in prevoz metabolitov v viriona.

Še posebej so bili veliki koraki vložen v študiji morfologije rotavirusa s spreminjanjem TEM - krioe-elektroni mikroskopija, ki omogoča preučevanje nativno nepobarvana virionskega 35A z ločljivostjo, ki omogoča, da razkrije površinske strukture virusa in kanale predira virion (Yeager M. s sod ,. 1990- 1994, Estes M., 1996- Prasad V. et al., 1996).

Tako je neposredna elektronska mikroskopija je učinkovita diagnostična metoda in optimalno refe-Laurence test pri razvoju novih diagnostičnih metod v luči nastalih nesporno rezultatov, ki izhajajo v številnih raziskovalcev verjamejo, elektronska mikroskopija "zlati standard" (Bryden A. S., 1990). TEM je edinstven v njegovo sposobnost, da zaznajo vse razen rotavirusov in drugih črevesnih povzročiteljev bolezni skupin: adeno, kalitsi-, astro in koronavirus, kot tudi doslej neznanih infekcij (Espinoza F. et al, 1997).

Immunoelectron mikroskopija (IEM) daje priložnost, ne samo, da prepoznajo virus v materialu iz pacienta po svojih morfoloških znakov, temveč tudi za potrditev etiologije bolezni na določeni ravni. Načelo študije je naslednji: imunskega seruma rotavirusi v razredčitvi 1: 5 zmešamo z 0,4 ml 1% odpade suspenzije s centrifugiranjem očiščene. Zmes smo inkubirali 1 uro pri sobni temperaturi in 12 ur pri 4 ° C, nato centrifugiramo 90 minut pri 15 000 rev. / Min do pelete virusnih delcev, imunskih kompleksov. Nadosa-zling oddekantiramo in resuspendirali v nekaj kapljic destilirane vode, obarvanih (kot je navedeno zgoraj), in se uporablja za predmet mesh. Mikroskopija je bila izvedena s povečanjem zdravili 50.000.

V tem primeru so rotavirusi delci z značilno morfologijo in velikost označene s specifičnim imunskim tvorbo kompleksa, ki intenziteta je ovrednoten s številom skupin na rešetko, ki je izražena z arbitrarno lestvico od 0 do 4+ noter.

Občutljivost in specifičnost IEM lahko tekmujejo samo z EMP, ampak tudi s tako skupno metodo, kot je ELISA. Tako je za tipkanje 24 sevov rotavirusov ELISA in IEM osnovi monoklonskih protiteles proti VP7 je bilo, da IEM v 2-16-krat bolj občutljiva kot ELISA (Gerna G. et al., 1988).

Poleg standardne tehnike IEM v delih nekaterih avtorjev študiral specifičnost in občutljivost s številnimi spremembami te metode: Filtriranje kompleks agar imunski IEM in makromarkirovaniya kompleksne beljakovine koloidno zlato. Izkazalo se je, da so vse spremembe IEM vsaj 20-30 krat bolj občutljiv od neposrednih metod. Največjo občutljivost izvedba razlikuje označeni protein A - koloidnega zlata, ki je 1000-krat bolj občutljiva kot neposredne metode MEN (Athanassions R. in ostali, 1994- Gonzalez S. A. et al, 1995..). Jasno je, da bo nadaljnje izboljšanje IEM odprla nove možnosti za to metodo, vendar je njegova visoka občutljivost je mogoče doseči s skrbnim standardizacijo reagentov, programska oprema con trol, kot tudi visoko usposobljenost raziskovalca.

Področje IEM je obsežna: raziskave in razvoj, klinična praksa, laboratorijska diagnostika, vključno s tipizacijo rotavirusi sevov prepis epidemičnih izbruhov, itd (Gerna G. et al, 1988- Vasiliev BJ et al, 1989- Bates ... R. R. et al., 1993- Oishi J. et al., 1993- Zeng C. et al., 1994- Tokieda M. s sod., 1996).

IEM (kot TEM) se uporablja tudi kot referenčni test za vrednotenje občutljivosti in specifičnosti indeksi komercialnih diagnostičnih kompletov (Ruggeri F. et al., 1992). Ilustrativne vrednosti, ki uporabljajo IEM Dekodirni postopek v epidemioloških izbruhih lahko služi podatkov Oishi J. (1993). Tako je, ko so izbruha gastroenteritisa pri študentih na šoli na Japonskem TEM morfoloških značilnosti v iztrebkih bolnikov, je pokazala, rotavirusov. Poleg tega imajo ti materiali negativna ELISA relativno vstopi rotavirusa filter A. Uporaba IEM pokazale, da so te rotavirusov zastopniki skupine C, ki je bila kasneje potrjena s podatki PCR.

Povzema rezultate TEM in IEM, je treba opozoriti, da imajo te metode izjemen pomen v začetnih fazah diagnozo rotavirusi. Vendar pa v prihodnosti, z razvojem metod odkrivanja rotavirus antigenom vrhunsko FEM IEM in občutljivosti, enostavnosti in hitrosti možnosti pregleda veliko število nizkih materialnih stroškov, TEM in IEM je dal častno vlogo referenčnih metod.

Ob istem času, TEM in IEM in doslej uporabljena v raziskave in klinični praksi, obe metodi za odkrivanje novih povzročiteljev okužb niso znani.

Postopek Imunofluorescenčni (min) uporabimo za diagnostične teste za odkrivanje antigena v celični kulturi okuženih materiala iz pacienta, pri biopsijah in obdukcije materiala ter kopromaterialah dve spremembi.

Načelo neposredne metode IPM znižanem predelovalni objekta (okužene celice ali dele tkiva) specifična protitelesa označena s fluorescentnim barvilom, ki je v stiku z antigenom, zagotovi fluorescenčnem mikroskopu pod vplivom kratkega valovne dolžine vidne valovno dolžino luminiscence (zeleno ali rdeče, odvisno od vrste barvila) . Pri posredni metodi se predmet podvržemo dvostopenjskem procesu, prvi imunskega seruma za želeni antigen, in nato označeni s fluorokromom imunoglobulinov izolirane iz seruma antispecies.

Metodologija IPM je zelo preprosta: umazanije, okužene celice, pojasniti odpade suspenzijo so pritrjene na diapozitive z acetonom pri sobni temperaturi 10 minut. Pripravek smo nato obdelali s fluorescentnim rotavirusnim serumom pa kontrastne barve albuminsko-rodamin konjugat. Po inkubaciji pri 37 ° C za 30 minut, je bil presežek konjugat izperemo s fosfatnim pufrom (pH 7,0), sprali, posušili in si pod fluorescenčnim mikroskopom. Opozoriti je treba, da ob kopromaterialov v prvih urah po nastopu poveča možnost za odkrivanje rotavirusni antigen. Pri izvajanju IPM treba vključiti kontrole, ki se uporabljajo v glavnem: Zdravljenje posebnega konjugata neokuženih celic-vanje, in - heterologne konjugat celic, okuženih z rotavirusom. Najpogosteje se uporablja v študijah IPM tkivne kulture materialov okuženih iz človeškega ali živalskega pacienta, ki vam omogoča hitro zaznavanje virussoderzhaschie.kletki brez čakanja na CPP (Isrc otoki LA, 1988- Harsi C.et al., 1991- Tokieda M . et al., 1996). 46 (17,1%) - do 40 pozitivnih vzorcev (14,9%), v testu immunnofermentnom bile ugotovljene v raziskavi v integrirano kot EF pri bolnikih z gastroenteritis STRANI 268 otrocih, mlajših od 1 leta. Sovpadanje rezultatov teh metod so opazili pri 72% primerov (Harsi C. et al., 1991).

V zadnjih letih je imunofluorescenčni protitelo nalepka pogosto uporabljajo za odkrivanje žarišč (plyak) rotavirusa v celični kulturi, ki močno izboljša občutljivost te metode (ISA P.et al., 1994- Barnes G. et al., 1997). IPM se uporablja, in za odkrivanje rotavirus v zunanjem okolju (Strappe R., 1990).

Tako je trenutno imunofluorescenčni metoda raziskovanja v klasični različici je omejeno uporabo pri diagnozi rotavirusnim gastroenteritisom.

Testi Pretsipitatsionnye temeljijo na interakciji z serumu določenih virusnih antigenov v agarju pod vplivom osmotskih procesov (RPG) ali če izpostavimo statičnega električnega polja - nasprotno imunoelektroforezni (VIEF) (Galko NV sod, 1986 Zalesskikh A. F. et al. ., 1990). Te metode so bile uporabljene v zgodnjih fazah preučevanja rotavirusi in je zdaj skoraj ne uporablja v zvezi z razvojem boljših testov, z izjemo fine raziskave (Devitt S. et al., 1993). Vendar pa so pretsipitatsionnye Testi izboljšati z uvajanjem v delce Reakcijsko rotavirusom označene s 32P, kar bo povečalo tako občutljivost in specifičnost testa (Tosser J. et al., 1994- Johansen K. et al v zadnjih letih., 1994- Richardson S . et al., 1993- Colomina J. et al 1998.,), kot tudi protein Streptococcus aureus (Colomina J. et al., 1998).

Povezane imunski test (ELISA), pri prepoznavanju rotavirusnim gastroenteritisom uporabljamo najpogosteje. Število objav na to temo, več sto.

Princip metode ELISA zmanjša na dejstvo, da nosilec iz polimernega materiala (mikro plošče vrtine, kroglice, palice in tako naprej. D.) prevlečeni s protitelesi proti rotavirusom dodane preskusni material iz pacienta in inkubirali pri 36 ° C Nastali kompleks AT-AG Zaznali ali protitelesa označeni z encimi ali seruma najprej obdelamo na želeni antigen, in potem učijo iz dobre Antiva-imunoglobulina označenega z encimom. Dokaz kompleksa AT-AT + AH encima ali AT-AH-AT1-AT2 + z dodatkom encimskega substrata za zunanji videz obarvanega reakcijskega produkta izvedli. Obravnava rezultatov reakcijo opravimo z uporabo encimskim imunotestom analizatorje. Poleg odkrivanje rotavirusnega antigena lahko ELISA izvede tudi serotipizacija se izolira v materialu iz bolnikov. V ta namen je bila metoda blokirni spremembe določeno epitope RV genoma z uporabo monoklonskega protitelesa tipa ali podskupine specifičnost (Green K. et al., 1990). Uporaba monoklonskih protiteles vp7 in VP4 različnih serotipov človeških rotavirusni omogoča ne le za vnos izolate, ampak tudi spodbuja preučevanje epidemične procesov (Bishop R. et al., 1989- Gerna G. et al 1989- UnicombL. Et al., 1993- Buesa G . et al., 1996- Gomez J. et al., 1990- Begue R. et al., 1992- Coulson BS, 1993- Woods P. et al., 1992- Nirdnoy W. et al., 1995- Wu H . et al., 1998- Masen-dyzac P. et al., 1998).

Prvi ELISA so nastale kot laboratorijskih testih ob koncu 70-ih, in so bili razviti nato pa komercialnih izdelkov. Prvi komercialni izbiranje je Rotazyme (Abbot Laboratories Ltd), ki je bila uporabljena v kemični sistem. Potem je Dako Ltd ustvarila bolj popoln nabor - Fast Elisa Dako Ltd, in zdaj število komercialnih testov, ki se uporabljajo v diagnostične praksi, je zelo visoka: Test IDEIA rotavirusom, Dakopatts, preskusni sistem WHO, Testpack rotavirusom, rotavirusom EIA, Pathfinder, Kallestadt | Rotaclone, Rotavirus BIO - Bioenzabead Litton, Rotazyme II Abbott, Rotoscreen, Wellcozyme, Enzymgnost rotavirusom, rotavirusom imunski Vidas rotavirusom, NIV (Gowez J. et al, 1990- Begue R. et al, 1992- Rosmus K. et al .. ., 1992- Kelkar S., 1993- Unicomb L. et al., 1993- Sanchez R. et al., 1993- Broor S. s sod. 1993- Dennehy P. et al., 1994).