Virološki študije. Črevesnih bolezni. (Part 5)

Primeri uporabe Western-blot za proučevanje struktura proteinov sporočila RRV-2 SA-11, DS-1 je delo Pavlov in sod. (1991). Uporaba hiperimuni serum avtorji izvaja analizo imunoblot od VP1, VP2, VP4, VP7 - referenčnih sevov rotavirusom opic in ljudi. Kasneje, Zeng Q. et al. (1994), z uporabo Western-blot, nato z uporabo monoklonskih protiteles za imunskimi odtisi, VP2 preučil funkcije, SA-11, delcev sestav mehanizem VP2, VP2 / 6 in transport metabolitov v jedru.

Najpogostejši način molekulske hibridizacije je RNA-RNA hibridizacija v dot-blot in Northern-blot. Dot-blot (pika hibridizacija) je najbolj neposreden eden za molekularno hibridizacijo, ki omogoča kvantifikacijo virusnih nukleinskih kislin. Northern-blot - varianta molekulske hibridizacije, kjer ločevanje nukleinske kisline ekstrahiramo s elektropotopni matrice, ki se prenese in imobiliziran na trdni fazi površini v istem zaporedju, kot so v gelu. Hkrati je uporaba Dot-blot'e in Severna blot'e sond na specifičnih genov rotavirusov, vključno z VP4 in VP7, omogoča izolatov smo vnesli neposredno v materialu bolnika.

Molekularna metoda hibridizacije uporablja pri diagnosticiranju okužb z rotavirusi (Novikova, A. et al., 1991, 1998- Kraško A. G. et al., 1991 Ginevskii VA et al., 1992- Fer-nandoz J. et al., 1992- Steele et al., 1996- Husain M. s sod., 1996), vendar bolj pogosto za naloge, kot tipkanje izolat študijske netipične sevov interspecifična in Medskupina preureditve, med študije molekularnih epidemioloških, in interspecifična in medskupina preureditve (Gorrell RY sod, 1996- Kuzuya M. s sod, 1996- Nakagomi 0., Nakagomi T., 1991 (a, c) - .. 1996- Ward R., 1990, 1991- Qian Y. et al., 1991- Palombo E. s sod., 1998).

Teoretična možnost uporabe kapljico hibridizacijo za diagnozo infekcije človeškega RV dokazali Krasko A. G. et al. (1991). Kot uporabljamo sonde 32P-označeno prašičjo RV genomskih segmentih, prepisana in vitro z aktivacijo endogeni RNA odvisnost Sima RNA-polimeraze in prepisi Dobimo za vse 11 koščkov RV.

Uporaba te metode z uporabo sonde v RNK RV SA-11, označeni tudi z 32P, dovoljeno Novikova N. A. in sod. (1991) za odkrivanje RV RNA v nazofaringealni brisa 29 (76,3%) od 38 bolnikov RVGE, ki potrjuje možnost RV genom prepisovanje v celicah sluznice žrela.

RNK-RNK hibridizacija diagnostična vrednost je bila dokazana Fernandoz J. et al. (1992) 303 pri kontrolnih vzorcev blata pacientov RVGE z dot-blot. Oligonukleo tidny-sonda sestoji iz 40 območju 33-72 VP7 genske nukleotidov, najbolj konzervativni veliko rotavirusov. Kot etiketa biotin (biotin-dATP 7). Skupaj z dot-blot smo uporabili EF straneh in ELISA. Ni bilo ugotovljenih 230 pozitivnih primerov, ki jih dot hibridizacija in EF STRANI potrjeni. ELISA izkazal manj zanesljiva, ki je pokazala, 7 lažno pozitivnih in lažno negativne vzorce 12. Občutljivost te metode je 200 pg (Fernandoz J. et al., 1992). Ločljivost Northern-blot je bila močnejša in pustimo 6,0 pg odkrivanje homologni RNA, kjer sonde ne reagirajo tudi z 100 ng heterolognega RNA (Ali A. et al., 1993).

Uporaba posebnih sond na različne G- in P-type je odprla možnost, da bi dobili jasno sliko o obtoku rotavirusi na različnih geografskih območjih (Sethabuthz O. et al., 1992- Husain M. et al., 1996- Correll Ry et al., 1996- Isa P. et al., 1996- Ada M. s sod., 1997).

RNK-RNK hibridizacija je omogočilo dokumentirati prisotnosti medskupine preureditve, ki se pojavi in ​​vivo, kot tudi pri gojenju rotavirusni pripadajo različnim genskima skupinama na celični kulturi (Ward R., 1990- 1991).

Ta metoda je tudi možnost, da bolj natančno opredeliti članstvo določenega virusa v določeni skupini. Rotavirus nekatere oddelek I in II podskupine na tej stopnji ni povsem neresnične, tj. Ni vse izolate. Fit "v že znanih značilnosti. Na primer, AU-1 sev ne ujema z značilnosti podskupin I, ki ima kljub temu dolgo foretipom. Samo uporaba možne hibridizacije podatkov RNA-RNA, da prepoznajo ta pritisk in jih podobno izolira v ločenem skupini (Nakagomi O., Nakagomi T. 1991 (a, b) - 1992). Poleg tega je RNA-RNA hibridizacija razvršča rotavirusni na genetski ravni (tj. N. Genogrouping), kar je zlasti pomembno za proučevanje atipičnih rotavirusom izolatov (Nakagomi G., 1996).

Poleg RNA-RNA hibridizacije kaže uporabo hibridizacije RNA-DNA (Južna blot). komplementarna DNA (DNA) smo dobili ta namen z reverzno transkripcijo genomske RNA v različnih segmentih. Izkazalo se je, da je najbolj učinkovita hibridizacija opazili, ko se uporablja kot sondo cDNA na segmentu 3 RV genoma. Kot oznak, ki se uporabljajo pri 32P. Učinkovitost dot-blot hibridizacije RNA-DNA je bila 0,5 ng. V tem posebnem študijah je prikazano, da cDNA sonde uporabljeni ne dajejo navzkrižnih reakcij z drugimi skupinami RV RNA (Eiden J. et al., 1989).

Opozoriti je treba, da je delež zelo RNA-DNA hibridizacija za razlikovanje serotipov v prisotnosti 50% formamida prodira reakcijo ozko specifično (Rosen V. et al., 1990). Še več, vodenje reakcije hibridizacija je možno ne samo oligonukleotidi so označeni s 32P, ki pa alkalne fosfataze (ALP). Poleg tega uporaba obeh markerjev v študiji 148 vzorcev s hibridizacijo RNA-DNA pokazala podobne rezultate (Sethabutr O. s sod., 1992).

Južna blot se pogosto uporablja pri odkrivanju rotavirusom genoma in okolja. Uporaba RNA-DNA hibridizacija RV bila odkrita v pitni vodi, zemlji, odpadna voda (Ginevskii VA et al., 1992- Zothikumae N. et al., 1995- Grinde V. et al., 1995- Dubois E . et al., 1997).

Tako so metode hibridizacije označen neprimerno večjo občutljivost in specifičnost kot laboratorijske teste in se lahko uspešno uporablja kot referenca za vrednotenje. So univerzalni način diagnosticiranja in tipizacijo rotavirusi in omogoča tipkanje dne se izolira v materialu od bolnikov.

V zadnjih letih osnovi so zadnje biotehnologije in genskega inženiringa razvil edinstveno metodo diagnosticiranja virusnih nalezljivih bolezni z uporabo polimerazne verižne reakcije (PCR). Za razliko od običajnih tehnik ELISA blot hibridizacija, ki zagotavljajo zanesljivo odkrivanje 0,1-10 milijonov ciljne molekule (antigenov ali nukleinskih kislin), PCR metoda omogoča, da prepoznajo samo eno molekulo nukleinske kisline v vzorcu.

PCR temelji na dveh osnovnih lastnosti nukleinske kisline - porazdelitvenih sintetiziramo dvojnih pramenih genomske DNA in ponovno sintezo na osnovi teh dopolnilnih nukleinskih struktur.

Za reakcijo testnega vzorca s proteinazo K in fenol-kloroform izolirane nukleinske kisline (Oischi J. et al., 1993- Gouvea V. et al., 1991). V zvezi s potrebo po uporabi toksičnih snovi, kot so fenol, kloroform, inhalatorjem, je bil postopek nadalje razviti dvojne vijačnice izolacijo RNA in čiščenje, ki temelji na uporabi gvanidina in gidrooksiapatita tsetiltri metil-amonijev bromid (Santos N., Gouvea V., 1994) . Postopek je enostaven, učinkovit, omogoča sprostitev RNA iz encimskih inhibitorjev, in daje večji donos virusne RNA. z žarjenjem (90 ° C) denaturiran nukleinske kisline so dani v mediju, dopolnjenem s primerji nukleinskih kislin in termostabilno DNA polimerazo. Pri 36 "C na ločenem verige DNA s polimerazo DNA sintetizira komplementarno strukturo. Primerji določi, kateri je del RNA reproducirati, in dodajanje končnih kodonov za posledico dejstvo, da je polimerizacija ne po celotni dolžini verige DNK, in samo en del verige, odgovoren za posebne funkcije genom, t. E. Gruppo-, tipa, ali serospetsificheskie genom sekvenco. Temperaturo nato dvignemo na 58-60 ° C, kar ima za posledico sintetiziranih dvojnih prelomov verige. Temperaturo nato znižamo na 36 ° C in sinteza komplementarnih pramenov se ponovi v dveh odsekov že verige in t. D. Zaradi pogostega ponavljanja tega postopka, je število strogo specifična za vsako patogenih nukleotidnih zaporedij povečala za več velikostnih razredov. Teoretično občutljivost preprosto odstranimo, kot je v tem primeru ene verige lahko dobili 1000-kratno akumulacijo nukleotidnih zaporedij. Ta metoda ne zahteva radioaktivne izotope oddana milijon krat bolj občutljiva kot standardni metodi z uporabo elektroforeti-jutranje dsRNA - genomskih segmentih, in 5000-krat bolj občutljivo tehniko molekulske hibridizacije (Xu L. et al, 1990) .. Po Eiden J. et al. (1991) občutljivost PCR v rutinsko raziskovalnih pristopov femtokolichestvam (80 fg).

Omeniti je treba, da, kot se vhodna Molekula za PCR lahko uporabimo v DNA ali cDNA, pripravljeno iz RNA z reverzno predobdelave traskrip-tazoy sledi pomnoževanjem. RNA vrniti obeh sveže pripravljene celice, tkiva in zamrznjeni,-liofi lizo sredstvi ali fiksne, tj. E. predmete že na voljo za analizo. Ta vrsta je znana kot PCR revertaznoy opazil transkriptatsionnoy verižne reakcije s polimerazo (RT-PCR). Bistvo te spremembe je uporaba PCR oligonukleotnyh par oligonukleotidnih sposoben specifično hibridizirati s nukleotidnih zaporedij na nasprotnih koncih dva DNA verige odseka. Kot primerji za simultano sintetiziranje komplementarne sklope z uporabo termostabilne DNA polimeraze. Ponavljajoče cikluse denaturacija pramenov dvojne vijačnice DNK po končanem žarjenju s primerji privede do eksponentnega povečanja števila fragmentov DNA z nukleotidnih sekvenc, ki ustrezajo primarno strukturo oligonukleotidnih začetnikov obdajata. Posledično je količina 30-40 ciklov pomnoževanja reakcijo DNA molekul v vzorcu v 108-108 roki, kar omogoča določitev TsPDvo 104 / ml povečala in ne daje navzkrižnih reakcij z drugimi virusi (Kweon S. N. et al., 1997). Hkrati pa nobena od RV primarnih parov ni odzvala v RT-PCR z fekalnih vzorcih, ki vsebujeta rotavirusni druge skupine, kot tudi vzorce iz kontrolnih zunaj okuženih ljudi in živali, kar kaže visoko specifičnost metode (Eiden J. s sod., 1991).

Pomnoževanje sekvence je mogoče videti na UV luči PCR produkta po frakcionacijo z gelsko elektroforezo v prisotnosti etidijevim bromidom (Gouvea V. et al., 1991- Oishi I. in sod., 1993). Dobljeni količina fragmentov DNA zadostuje za analizo z drugimi molekularno-bioloških metod: dot-blot hibridizacije, zaporedja, kloniranje in drugih.

Trenutno izvaja izbor primerje za odkrivanje rotavirusa skupine A, B in C genov, 9, 8 oziroma 6. (Gouvea V. et al., 1991- Oishi I. et al., 1993- Buesa I. in sod., 1996 ). Metoda RT-PCR smo uporabili za določanje rotavirusov tudi v primerih, ko druge metode ne omogočajo njihovo identifikacijo (Ushijima N. et al., 1992- Oishi I. et al., 1993- Jiang B. s sod., 1995). V zadnjih nekaj letih smo predstavili podatke o uporabi PCR za G- in R-serotipa RV. Avtorji so pokazali, da je najpogosteje pri ljudeh rotavirusni spadajo k tipom G1-G4 in P4, P6, P8 in P10 (Taniguchi K. et al., 1992- Correll RJ, Palombo AE 1996- Husain M. s sod., 1996- Espinoza F. et al., 1997). Ti podatki nam omogočajo, da hitro dobiti podrobne informacije o molekularni podlagi epidemioloških sprememb rotavirusov, ki je zelo pomembno v epidemiologijo in pri gradnji cepiva proti rotavirusom (Richardson S. et al., 1998- Leite I. et al., 1996- Arista S. et al., 1997- Ada M. s sod., 1997).

Kljub velikemu številu študij potrjujejo vrhunsko specifičnost in občutljivost PCR, številni avtorji izvedli primerjalni test te metode s tradicionalnimi diagnostičnih metod: ELISA, EF PAGE, TEM. PCR višjo občutljivost v primerjavi z ELISA dokazali Wilde J. 103 blata vzorec smo dobili 40 Preučevanje otrok. PCR Zaznali 60 pozitivnih primerov (53%) v primerjavi z 37 (36%) v IFA. Poleg tega je bilo povprečno trajanje izločanja virusa enaka 9,5 dni za podatke PCR, v primerjavi s 5,6 dni v IFA (Wilde J. et al., 1991). Podobne rezultate, kar kaže na visoko občutljivost PCR v primerjavi z ELISA, pridobljeni identifikacija Tani-guchi K. 115 kopromaterialov iz bolnih otrok izumitelji, da je diagnoza potrjena s PCR v 93% v primerjavi z 82,6 ELISA. (Taniguchi K. et al., 1992).

Novejše delo je v celoti potrdil te rezultate. Tako, s primerjavo PCR stran in ELISA se uporablja za odkrivanje rotavirusov v materialih bolnih otrocih je odstotek pozitivnih ugotovitev je: 94, 91 in 80%, oziroma (Husain M. s sod, 1995). Podobne rezultate smo dobili pri pregledu 220 bolnikov IKP. Odstotek detektiranje rotavirus v materialu posameznikov nadzoruje PCR, ELISA, SDS in TEM, oziroma za 30, 29, 26,8 in 25,4 (Buesa J. et al., 1996). . Po Masendyacz R. in ostali, občutljivost in specifičnost, metode odkrivanja tri RV kopromaterialyah bile driska bolniki: PCR - 92 in 98% - RNA-DNA hibridizacija - 80 in 99% - IFA - 73 in 81% (Masendyacz R. et al., 1998).

Kot je razvidno iz sporočenih podatkov, analiza rotavirusom RNK se vedno izvajajo v praksi, kljub določeni zapletenosti in visokih stroškov raziskav, in se uporablja tako za diagnozo in za karakterizacijo patogena. Ta proces se je okrepila z razvojem PCR, najbolj občutljivo, specifično diagnostično metodo, ki je po mnenju mnogih avtorjev, je trenutno "zlati standard", kar je prej je bil TEM (Nakagomi O. et al., 1994- Masendyacz R. et al ., 1998).

Tako PCR je molekularno biološki preizkus nove generacije, ki odpira veliko možnosti za razvrščanje, tipkanje, splošne in molekularne epidemiologije rotavirusi. Vendar pa je treba opozoriti, da je PCR zahteva visoko usposobljene raziskovalce, dragih reagentov in relativno zapletena oprema. Ob istem času, še izpopolnitev metode, je očitno, da bi PCR bolj dostopna za široko paleto diagnostičnih laboratorijev.

Povzema uporabo metod za opredelitev rotavirusov v različnih raziskovalnih zmogljivosti, je treba opozoriti, da je praktično vse gradivo, obravnavano v tej metodi, tako prednosti kot slabosti, izražene v različnem obsegu. Prejemanje hitrost odziva, sposobnost za raziskavo veliko število vzorcev hkrati, metoda kompleksnosti in potrebe po uporabi drage opreme in reagentiki, občutljivost in specifičnost metode in, nenazadnje, stroški analize vsakega od teh metod zelo razlikujejo. Zato - izbira ustrezne metode v vsakem primeru je individualno in ni lahka naloga, zaradi velikega števila testov, različne možnosti diagnostičnega laboratorija in izzive, s katerimi se srečujejo.