Rv III cepiva generacije. Črevesnih bolezni.

Naredili smo tudi poskus, da bi opredelila "prazne" virionov iz koprobiomassy RV. Uporaba hitre centrifugiranjem v nezvezne gradientom gostote cezijevega klorida ali sulfata (1,0-1,5 g / cm2) smo lahko razdeli delci RV "polni" in "prazno", ki je bila potrjena z mikroskopskim kontrolo elektronov.

Tako je bilo ugotovljeno, možnost lij RV njihova plavajočo biomaso gostote zajamčeno, da se lahko uporablja kot sredstvo ali stopnji čiščenja, koncentracija in kopičenje virusnega materiala pri načrtovanju diagnostičnih in preventivnih zdravil (Vasile v B., J. et al., 1991) .

Razvoj genskega inženiringa pristop pri ustvarjanju cepiv RV se kaže v poskusih, da simulirajo tako imenovano cepivo podenoto.

Uporaba HPV kot cepiva kandidatke, ki povzročajo zaščitni učinek na cepljenje, da je določeno evolucijsko pot. Postopek za pripravo formulacije cepiva na osnovi VP6 bila predmet prijave za izum (Sahara M. s sod., U.S. patent, 1990).

Avtorji izdelani pripravki, ki vsebujejo epi-topnye molekule vezan na proteinski nosilec monomerov ali oligomerov polipeptidov homolognima VP6, ki tvorijo HPV. VP6 gen smo izolirali z rekombinantnimi plazmidi, nato pa kompleks z različnimi polipeptidov RV.

Prej je izkazalo, da ima notranji kapsidnega VP6 proteina te zmožnosti samo-sestavljanje. Na podlagi tega pojava je zdaj spoznal možnost pridobitve virusom podobne delce (HPV) za imunizacijo živali. RV geni, ki kodirajo strukturne proteine, smo klonirali v bakulovirus in rekombinantnih RV so-izražajo proteinov v bakulovirusnim sistemu (Estes MK et al., 1996- Crawford S. E. et al., 1994- LABBE M. s sod., 1991). Izražene proteine ​​samosobira-RV tvorjena in HPV. Sočasna izraz različnih kombinacij strukturni proteini HPV vodi do tvorbe različno sestavo beljakovin.

Zadnji podatki kažejo, da parenteralno dajanje inaktiviranimi RV laboratorijskih živalih vodi v njihovo popolno zaščito pred homologne oralno okužbo, zaradi česar je bilo mogoče oceniti možnosti alternativnih načinov cepljenja s HPV.

Uporaba kloniranje in ekspresijo v bakulovirus sistema strukturni proteini VP4, VP6 in VP7 RV RNC (sev C 486) Redmond M. s sod. (1993) so bili dobljeni s HPV, ki obsega na osnovi VP6 ali VP4 ali VP7. Miši v poskusih oblikovan HPV izzvalo humoralnih protiteles z MEN odkrite. Vendar le HPV VP4 vzbudil protitelesa, ki nevtralizirajo virus in hemaglutinacije inhibiranje. Infekcija miši imuniziranih s prisotnostjo HPV VP4, si je zaščitni učinek proti homologne (C 486) in heterolognim (SA-11) RV. V nasprotju s tem potomcev miši obdelamo samo s prisotnostjo HPV VP6 izkazali delno zaščiten.

Nato imunogeno aktivnost in učinkovitost zaščite parenteralno dajanje HPV različno sestavo (VP6 / 7, VP2 / 6/7, VP2 / 4/6/7) in adjuvansi A1 OH, QS21 smo preučevali Conner ME sod. (1996).

Avtorji izdelana drug HPV sestavka med Sočasna okužba Sf9 celice (0,2 ali 5 pfu na celico) z različnimi kombinacijami bakulovirusnimi rekombinanti (Crawford S. E. s sod., 1994). Bakulovirusom rekombinante so bili uporabljeni pri modeliranju HPV kodiranega VP2 (RF) ali VP6 (486 C) KRS- VP6, P [2] VP4 ali G3VP7 opica ali Gl VP7 (8697) HRV. HPV smo očistili z gostoto gradientom cezijevega klorida ali 40% saharoze.

V procesu testiranje različnih sestavkov HPV rekombinante strukturni proteini dvakrat injiciranih miši (0,2-20 ug) in zajce (10-20 mg), sledi okužbe z RV SA-11 in ALA. Ugotovljeno je bilo, da kunci cepljena s VP2 / 4/6/7 ali VP2 / 6/7 inducirano visoko stopnjo RV seruma in coproantibody IgG razreda, vendar ne IgA in indukcija odpade IgG povezano s popolno ali delno zaščito pred oralno okužbo RV ALA. In to ni našel vpliv koli adjuvans na intenziteto imunskega odziva. Pri miših, so bili podobni rezultati doseženi razen adjuvans s QS21 HPV induciranega odziva protiteles (za podatke ELISA in Ph) primerljiv s tistim, doseženim z imunizacijo RV SA-11. Intenzivnost imunoloških sprememb je odvisen od odmerka HPV. Treba je opozoriti, da so miši, imunizirane s VP2 / 6/7 ali VP2 / 4/6/7 so tudi odkrili in heterotipičnega serumu in coproantibody. To dejstvo je še posebej pomembno, saj kaže na možnost zmanjšanja števila G-vrste, vpisanih v cepivu podenot, in to, po drugi strani predlaga možnost oblikovanja HPV z omejenim številom beljakovin, s čimer se zmanjša njihove stroške. V zvezi s HPV VP6 / 7, pa so bili tudi imunogen pri miših, vendar je njihova relativna nestabilnost ni pomagala njihova obravnava kot potencialne kandidatke za cepiva. Kot rezultat testov, so avtorji zaključili, da se lahko s HPV zagotovi varno in učinkovito alternativo ali dodatek k živo cepivo RV za ljudi in živali (Conner M. T. et al., 1996, 1997).

Ocenjevanje učinkovitosti različnih HPV, poti uporabe, kot tudi njihovo sestavo in namenska novo Imunoadjuvantna dela O'Neal S. et al. (1997). Avtorji so proučevali imunogenost in zaščitno učinkovitost oralno in nazalno dajanje RV podenoto cepivom, ki vsebuje VP2 / 6 in G3 2/6/7 zmešamo s kolera toksin. Ugotovljeno je bilo, da je peroralno dajanje na miših odraslih navedeno HPV povzroča videz v serumu in IgA in IgG coproantibody razredov. Poleg visokih odmerkov (100 mg) pomagal zaščititi HPV iz naknadne okužbe RV (> 50% zmanjšanje količine virusa) pri 50% miši.

Intranazalna Postopek dajanje HPV stimulirane intenzivnejša kot oralno in lokalno proizvodnjo serumskih protiteles. Miši, ki so prejemali HPV intranazalno, so zaščiteni pred naknadne okužbe, virusne izolacije po bila okužba odsoten. Ni bilo razlike v imunogenosti in zaščitnega učinka med 2/6 in 2/6/7 HPV. Poudariti je treba, da je bila zaščita dosežena brez zaščitnih antigenov VP7 in VP4.

Zanimivi rezultate smo dobili pri študiju učinkov Imunoadjuvantna - toksina kolere v imunogenosti in učinkovitosti zaščite s HPV. Intranazalno dajanje VP2 / 6 brez kolera toksin povzroča nastanek seruma in črevesnih protiteles pri nižjih titrov v primerjavi z imunološkimi premiki v njegovo uporabo.

Uporaba visokih odmerkih (100 mikrogramov) VP2 / 6 brez adjuvansa stimulira samo delno znižanje količine virusa za povprečno 38% okuženih miših.

Istočasno v podobnih pogojih imunizacije in naknadno okužbo miši zaščite visoki ravni, ko je bil uporabljen adjuvans dosežen z dozi imunogena desetkrat manjša (10 PG) kot uporabljena. Tako intranazalno dajanje HPV imunskega adjuvans, po mnenju avtorjev, lahko služi kot prototip za varno ne posnemajo RV cepiva ne samo za živali, ampak tudi za ljudi.

Poleg kolera toksin (CT) pod eksperimentalnimi pogoji so bili testirani tudi avtorji in temperaturno občutljiv toksin E. coli: LT in LT R129G.

Ugotovljeno je bilo, da je 2/6 HPV uporabo vseh teh immunoadjuvants jih povzročajo znatno zaščito miši proti kasnejše okužbe RV. Vendar pa miši, ki so prejele 2/6 HPV v kombinaciji z adjuvansom LT, proizvaja bistveno višje titre črevesne IgA protiteles v primerjavi z CT. Vse miši, ki so prejeli HPV 2/6 z LT in LT R192G, so popolnoma (100%) zaščiten pred okužbo RV, medtem CT - 91%. Imunoadjuvantna LT in LT 192G izkazala neškodljive in učinkovite imunske ki so omogočali avtorje, da jih priporoči za uporabo s HPV (O'Neal S. et al., 1998).

Kot je nova smer preprečevanja okužbe RV nedavno predlagala cepivo DNA, ki kodira strukturni proteini RV (VP4, VP6, VP7) in ima določeno zaščitno potencial. Pri razvoju cepiv iz zadnje generacije razen immunoadjuvants v kombinaciji sestavek dajemo kot ubite bakterije ali njihove antigeni, kot so Salmonella malopatogennye in tsitomegalovi-Rus, poliovirusa, adenovirus, virus koz.

Opozoriti je treba, da z vidika razvoja in uporabe kloniranih enterobakterij (zlasti E. coli), ki vsebuje fragmente genoma DNA humanega RV kodira sintezo antigenov virusa specifičnih obravnavanih v poznih 80-ih (WHO drog Inf., 1989). Kot vektorski sistem, ki se uporablja RV virus vakcinije (Poncet D. et al., 1990). Zaradi tega je razvoj genskega inženiringa zasnovan z rekombinantnim vaccinia virus vstavi v timidin kinaze genom cDNA, VP6 SA-11. Infekcija s tem rekombinantnim MA 104 celic povzročilo ekspresijo VP6, ki je induciran z imunizacijo postavitev miši protiteles, ne pa ima virus nevtralizirajočo aktivnost.

Imunski odziv na izražene rekombinantnih virusov vakcinije tujih antigenov se lahko močno poveča z "sidranje" slednjega na lupini postajajo okužene celice. Pomnoževanje imunogenost VP6 in VP7 lahko pojavijo neposredno preko celic B in aktiviranim T pomagalk (Andreja M. s sod., 1991).

Glede na to, da, kot je prikazano prejšnje ugotovitve, parenteralno zagotavlja RV cepiva pri miših in kuncih zaščite pred okužbo (Conner M. T. et al., 1993- McNeal M. et al., 1995), Herrmann IE sod. (1996 a) izvaja študijo na podlagi možnost uporabe DNA vakcine za preprečevanje okužbe RV. Cepiva proti rotavirusom DNA pripravimo z mešanjem komplementarno DNA, ki kodira mišji VP4, VP6 ali VP7, v ekspresijskem vektorju (Yasutomi Y. in sod., 1996). Cepivo RV DNA smo intradermalno dajanje z uporabo tako imenovanega gena pištolo (gen-pištolo).

Postopek «gen-pištola» obstoji v tem, da je DNA cepivo adsorbira na zlatih krogljic (0,95 nm), ki se vnese v povrhnjico z helij impulzov (Accell gen topniški Agracetus, Middleton, WI). Ta metoda je najučinkovitejši način za zagotovitev zahtevanega zneska DNA vakcine v povrhnjici (Fynan E. F. et al., 1993).

Plazmidne DNA cepiva (VP4, VP6 in vp7) so bili ocenjeni pri poskusih na miših odraslih (BALB / c) po svoji sposobnosti, da inducira imunski odziv in zaščito pred okužbo RV EDIM. Ugotovljeno je bilo, da zdravljenje miši podvojitev DNA vakcine 0,4 ug skupaj z zvišanjem titre protiteles IgG (ELISA podatki) v povprečju 1: 300 igrali VP4 in VP7 in 1: 3200 - imunizacija z VP6.

Hkrati z VNA določi pri miših, obdelanih z živim virusom (EDIM), VP4 DNA cepivo in VP7, vendar ne pri živalih imuniziranih z DNK cepivom VP6. Skupaj s povečanjem humoralnega titra protiteles povečano in vsebnost protiteles razreda IgA, je najvišja stopnja opazili pri miših z DNA VP6. CTL aktivnost smo merili za določanje celične imunosti. Če je razmerje efektor ciljna 60: 1 odstotno specifično lizo okuženih miši RV EDIM je enak 57 ± 27%, medtem VP4 cepljenja - 32 ± 14% - VP6 - 33 + 31% - VP7 - 42 ± 17% - plazmid kontrole DNK - 2 ± 2%.

Tako dvojni cepljenje plazmidne DNA VP4, VP6 in VP7 pokazala zaščito podobno kot pri miših, obdelanih oralno z živim RV EDIM 100 ID50- Hermann J. et al. To je pokazalo, da mehanizem zaščite izbral celične imunosti, IgA, posredovane znotrajcelično okvarjen nevtralizacijo virusa ali obeh teh faktorjev. Avtorji menijo, da so rezultati dokazujejo učinkovitost plazmida VP4, VP6 in cepiv VP7 DNA stimulira tako specifično protitelo in CTL (Hermann J. et al., 1996- Chen S. C. et al., 1997). Istočasno, Choi A. s sod. (1997) poročajo, da inducira visoko raven seruma pretežno IgG, je DNA VP6 ni sposoben zagotoviti zaščito proti kasnejšim okužbam.

V zadnjih nekaj letih, namenjenih za okužbo cepiva-ke-RV bili izrazi "sluznice cepivo" in "sluznice imuniteto". Sluznice cepiv sluznice (oralno, intranazalno, enteralno, vendar al.) In vključujejo specifične antigene in adjuvansov zaprte v mikrokapsulah, ki ščiti pred vplivi prebavnih encimov in odpornost na nizke vrednosti pH.

Postopek RV Mikrokapsuliranje temelji na sposobnosti ionnosvyazannyh vodotopnih anionski polimeri in amini poveča proizvodnjo virusa specifične imunosti, kar je razvidno Knoury S. A. et al. (1995), rjava K. A. s sod. (1995). Miši, imunizirane oralno inaktivirani inkapsuliranih neinkapsuli Rv-Rowan opico v odmerkih 1,75 mg ali 0,35, določi prisotnost specifičnih protiteles v serumu in črevesnih vsebin v kulturah organ gastrorezistentne povezan limfoidni (GALT). Ugotovljeno je bilo, da so virus specifičnih IgA proizvaja limfocitov tanke lamele proprie črevesja živali imuniziranih z dvema odmerkoma mikro-roinkapsulirovannogo opičjega RV. Miši cepljene z neinkapsuliran RV, so immunotolerance. Tako avtorji so pokazale, da lahko mikrokapsulirova nasajen učinkovito pri indukciji virus-specifičnih odzivni Galt po peroralnem dajanju majhnih količin virusnega antigena. Poleg tega so avtorji dokazali možnost mikroinkapsulirani cepiva z določeno obdobje biorazgradljivosti imajo obnovitveni učinek. Treba je poudariti, da je nov način za zagotavljanje cepiv za zaščito antigen pred učinki črevesne encimov in različnih motečih snovi, ga dali neposredno obliži na poloji (M. Estes, 1996).

Tako, da seštejemo razvoj fazah vaktsinopro-profilakso, je treba opozoriti, da je največji napredek pri zaščiti pred okužbo RV, povezane z razvojem in raznolikosti testov živi polivalentno reasortant cepivo zasnovan na podlagi skupne neto pristopu Jenny Rovsky in genski inženiring. V velikih kliničnih in epidemioloških raziskav, izvedenih v različnih regijah sveta, na kontingentov odrasle in otroke vseh starosti, so pokazale svoje neškodljivosti, nizko odzivnost, visoko imunogenega aktivnost in učinkovitost pri preprečevanju okužbe RV in tudi pri zmanjševanju pojavnosti hudih kliničnih oblik bolezni in hospitalizacije .

Najbolj obetaven od polivalentne reasortant cepiva so RRV-TV in WC3, ki je trenutno v fazi končnega testiranja pred izdajo dovoljenj.

Poleg zgoraj navedenih cepiv II generacije v zadnjih letih izdelanih podenote cepiva brez replikacije vektorske DNA, ki se nahajajo na predklinični stopnji potrjevanja.

Pozitivni rezultati, pridobljeni v eksperimentalnih pogojih pri živalih, kažejo, da je njihova študija lahko podaljša za ljudi.